第七章　人脐带间充质干细胞注射液制备的质量控制及安全性和有效性评价

脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cell，UCMSC）独特的生物学特性使其运用于临床成为可能，来源于人脐带的间充质干细胞即为人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUCMSC），严格按照临床应用级别的细胞质量要求、在合格的生产条件下由具有资质条件的技术人员从人脐带中分离获得经检测合格的hUCMSC为有效成分，用细胞保护剂等混合液配制、包装制成的符合生物制剂标准、满足活细胞产品要求、可直接用于临床治疗的hUCMSC细胞悬液即为人脐带间充质干细胞注射液（umbilical cord mesenchymal stem cell suspension injection）。

人脐带间充质干细胞注射液制备的核心内容主要包括获得合格的hUCMSC并配制成可用于临床治疗使用的生物制剂。因此，从脐带采集、细胞制备、细胞包装及冻存、各种试剂和耗材的选择都必须符合临床应用标准，质量技术要求远高于普通的UCMSC制备要求，只是hUCMSC制备和hUCMSC冻存的基本操作程序与普通UCMSC的制备和冻存的基本要求一致，但质量要求完全不同。因为人脐带间充质干细胞注射液是以临床治疗为目的而研发的UCMSC制剂产品，应按照国家新生物制剂研发的路线结合UCMSC自身的特点实施，必须建立标准化、规范化的材料采集和制备工艺技术，实施制备过程的全程质量控制，最终产品的质量需通过国家生物制品检测机构认定，临床治疗的安全性需经过国家认定并有细胞产品评价经验的新药评价机构利用标准化实验动物进行急、慢性毒性和致瘤性等验证和出具评价报告。疗效评价主要是针对UCMSC治疗适应证中的某种特定疾病，按照新药评价要求进行药效学研究，包括疗效评定、体内迁移分布、分化特征、表型转换、药代动力、作用机制等研究。在按新药研发要求完成临床前研究的基础上，按照新药注册程序申报并通过省级食品药品监督管理局核查后上报国家食品药品监督管理总局认定，获得批准后才能在国家认定的干细胞临床研究机构开展临床研究，经过临床疗效和安全性评价后才能在临床推广应用。目前，国家已经将活细胞产品列入药品类，启动了干细胞“新药”评审机制，建立了临床研究机构和管理机制，但国内尚未有研究机构或个人获得UCMSC制剂的细胞产品“新药”证书，也未见UCMSC制剂的标准化和临床推广应用管理政策和规范。笔者所在实验室参照国家卫生健康委发布的《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》《干细胞临床研究管理办法（试行）》、中国医药生物技术协会发布的《干细胞制剂制备质量管理自律规范》、国际干细胞协会发布的《干细胞临床转化指导原则》及国际细胞治疗协会提出的“定义间充质干细胞的标准”等干细胞研究规范，建立hUCMSC的分离、扩增、鉴定、冻存等技术体系，创制了可临床应用的hUCMSC液态细胞悬液，命名为“人脐带间充质干细胞注射液”。为促进hUCMSC技术的发展和为UCMSC相关研究者提供技术参考，这里将我们开展UCMSC临床制剂研发的经验、体会和做法进行总结分享。

1.hUCMSC制剂的制备应遵循《药品生产质量管理规范》（GMP）、《干细胞制剂质量控制和临床前研究指导原则》及《细胞制品研究与评价技术指导原则》以及其他适用的国家卫生部门发布的规范性文件的所有技术规范和基本要求。

2.hUCMSC制剂制备机构（以下简称制备机构）应建立符合GMP要求、完整的干细胞制剂制备质量管理体系，并设立独立的质量管理部门，履行质量保证和质量控制的职责。并且应根据hUCMSC制剂的特性及其制备工艺进行风险评估，并建立合理的质量管理策略。制备机构的工作区域应合理设计及布局。各功能区域应相对独立，应有满足其功能需要的空间、设施、设备和洁净度要求。质量控制区应与制备区实施物理隔离，行政区、生活区及辅助区等应不防碍hUCMSC制剂的生产。

3.hUCMSC制剂制备的内、外环境应满足其质量保证和预定用途的要求，应严格控制微生物、各种微粒和热原的污染风险。

4.hUCMSC制剂制备管理负责人、质量管理负责人和质量受权人应具有与职责相关的专业知识（细胞生物学、微生物学、生物化学或医药等），同时应具有5年以上的相关工作经验或接受过相应的专业培训，应能够履行hUCMSC制剂制备或质量管理的职责。制备管理负责人与质量管理负责人、质量受权人不得相互兼任。

5.从事hUCMSC制剂制备、质量保证、质量控制及其他相关人员（包括清洁、维修人员、物料仓储管理人员等）均应根据其工作性质进行专业知识、安全防护、应急预案的培训和继续教育。培训和教育的主要内容包括：①技术人员必须每半年进行1次健康体检的要求，传染性疾病患者不得参与UCMSC制备操作。②技术人员必须严格遵守实验室操作流程和规范，服从实验室管理人员的监督管理。③培养液的配制和细胞分离等开放性操作只能在100级超净工作台上的酒精灯前无菌区进行，严格执行细胞分离培养操作程序，避免一切影响细胞活性的操作发生。④严禁使用非临床应用试剂和耗材生产制备临床用hUCMSC制剂。⑤入库或提供临床使用的hUCMSC制剂必须详细记录存档。制备机构应建立档案资料，包括卫生及健康档案。对直接进行制备和质控操作的已离职员工档案，应至少保留30年。

6.从事hUCMSC制剂制备的人员、质量控制人员、包装人员应及时记录并报告任何可能导致污染的情况，包括污染的类型和程度。制备机构应采取严格的措施，避免体表有伤口、患有传染性疾病或其他可能污染hUCMSC制剂的人员从事制备、质量控制和包装的操作。

7.应建立设备、仪器、设施的管理档案，并建立唯一的编码标识系统，确保其使用情况的可追溯性，并对相关设备按照其说明书要求建立完善的使用及维护管理制度。

8.与hUCMSC制备、质量控制直接相关的仪器、设备，如灭菌柜、超净工作台、生物安全柜、空气净化系统和工艺用水系统等，应经过验证或确认，经质量管理部门批准后方可使用，并进行计划性校验和维护。

9.如采用电子信息系统进行管理，制备机构应建立电子信息系统的设计、运行、使用、升级、变更等管理程序，并对其运行的准确性和完整性进行定期验证。

制备hUCMSC注射液，采集合格的脐带是第一个遇到的关键环节，必须严格遵照以下程序和要求完成。

1.所有人源采集物的采集必须得到供者或其法定代表人、监护人的同意，并签署知情同意书。

2.采集机构应是取得《医疗机构执业许可证》的具有供者筛查能力的医疗机构。胚胎干细胞提供机构，必须是经国家相关部门批准的专业机构。制备机构应对采集机构或提供机构的资质进行确认，并定期进行评估。采集机构应制定采集标准操作规程，并备有采集过程中的应急预案。采集过程应严格执行标准操作规程并有真实记录，采集信息应双人复核。

3.采集工作应由采集机构的医护人员实施。采集人员应持有医师或护士执业证书，并经过相应的培训后方能进行采集。制备机构应向采集机构和采集人员明确采集物的质量标准、对采集信息和采集记录的要求、采集物发运前在采集场所的临时保存条件以及对采集物包装和发运的要求，必要时制备机构应对采集人员进行培训和指导。

4.采集过程应采取措施保护供者的健康和安全，并通过无菌技术操作最大限度降低污染、感染和病原传播的风险。采集用的接触采集物的试剂和物料应无菌、符合临床安全标准，且在有效使用期内。需由制备机构提供的无菌试剂和物料，应经过制备机构质量控制部门的验证并合格。

5.妊娠妇女的要求　脐带的采集应取得脐带所有人的知情同意和授权，并经伦理委员会批准，脐带来自足月剖宫产健康妊娠妇女。采集前应对供者进行HAV、HBV、HCV、HEV、HIV、TPPA、EBV、CMV、ALT、支原体等检测（表7-1），只有全部合格方能作为采集对象。作为细胞制备信息中的重要内容之一，需提供干细胞的获取方式和途径以及相关的临床资料，包括供者的一般信息、既往病史、家族史等。既往史和家族史要对遗传病（单基因和多基因疾病，包括心血管疾病和肿瘤等）相关信息进行详细采集。必要时需要收集供者的ABO血型、HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分型资料，以备追溯性查询。不得使用既往史中患有严重的传染性疾病和家族史中有明确遗传性疾病的供者作为异体干细胞来源。

6.医师或护士等待胎儿娩出后，常规结扎处理脐带，在距断段20~40cm处消毒后剪短，轻轻挤净血管中的血液，生理盐水冲洗干净，装入预先装有保存液的密闭一次性容器中，并贴上特制标签，标签上详细注明相关临床信息。脐带采集成功交由专职人员进行登记，编号，初筛，核对并在两小时内送到细胞制备实验室进行制备处理，脐带运输箱的温度一般应维持在4~8℃，可在运输箱内放置干冰以维持低温环境，运输过程中应避免激烈震荡。

7.采集机构和制备机构应建立供者个人隐私保护机制，确保个人信息受控。

8.应建立采集物的唯一标识系统，以配合后续的各个标识系统满足干细胞制剂的可追溯性。

9.采集脐带前后应收集产妇的相关检查报告单并复印保存，还应在采集后登记留取单位，产妇信息、住院号及新生儿出生时间，性别，体重等基本信息。UCMSC制备实验室应对采集来并接收的脐带相关信息进行核对交接，包括名称，数量，重量，供者信息，健康调查表等，然后转交档案室专人保存。

1.hUCMSC制备所用物料的供应商应经过质量管理部门的供应商评估并合格。物料接收前应确认供应商提供的该批物料的说明文件完整并符合相应的质量管理要求，说明文件包括但不限于说明书、合格证、组成成分说明、质量分析证书和化学品安全数据说明书等。如需要，应由专业检定机构对物料进行质量检验，并出具检验报告。

2.与hUCMSC直接接触的物料，应选择国家批准的临床应用产品，并建立抽样检验制度，达到所规定的质量标准之后由质量管理部门放行以供使用。如无国家批准的临床应用产品，应符合国家相关管理要求。

3.hUCMSC体外扩增培养所用的培养基应无菌、无病毒、无支原体及低内毒素，干细胞制剂中残留的培养基成分对患者应无不良影响。

4.培养基在满足hUCMSC正常生长的情况下，不得影响hUCMSC的生物学活性。

5.应尽可能避免在hUCMSC培养过程中使用人源或动物源性材料。如需要使用动物血清，应确保其无特定动物源性病毒污染。如需要使用猪源胰酶，应确保其无猪源细小病毒污染。严禁使用来自海绵体状脑病疫区的牛血清。

6.若培养基中含有人的血液成分，如白蛋白、转铁蛋白等生物源性成分，应尽量采用国家已批准的可临床应用的产品，并明确其来源、批号、制造商及制造商提供的质量检定合格报告。

7.hUCMSC培养过程中，尤其是在最后的培养阶段中，除非必要，不应使用抗生素。

8.hUCMSC制剂制备过程中所用的培养用液体，如盐溶液、消化液、缓冲液、水等，所有成分应满足要求的纯度级别（例如水应符合注射用水标准），并应无菌、无病毒、无支原体及低内毒素。

9.hUCMSC制剂中的重悬液成分应采用国家已批准的可临床应用的产品，每种成分应满足现行《中华人民共和国药典》的质量要求。如无临床应用产品，应符合国家相关管理要求。

制备hUCMSC注射液，分离扩增和纯化脐带来源间充质干细胞是十分重要的一个关键环节，必须严格遵照以下程序和要求完成。除了严格遵守普通间充质干细胞分离扩增的基本程序和要求之外，必须特别注意符合国家卫生部门制定的临床生物制剂的特殊要求。

1.在经检验合格符合GMP生产条件且具备完整的干细胞制剂制备质量管理体系的细胞工程实验室无菌条件下分离扩增脐带间充质干细胞，即取健康无传染性病原微生物（最低检测标准至少应符合临床输血要求，HIV、HBV、HCV、梅毒、CMV检测为阴性）的洁净脐带一根，经注射用生理盐水反复冲洗三遍以后，在无菌的培养皿中剥离杂质，将脐带剪切为0.5cm长的若干段，再将每段脐带在EP管内剪碎为1mm ³以下的糊状组织块。

2.使用临床应用级别的DMEM/F12完全培养基悬浮糊状组织块，并将其转移到经检验合格可用于临床应用组织培养的T175细胞培养瓶中，加入10ml已调整好pH值的DMEM/F12完全培养基，轻轻晃动培养瓶使组织块均匀分散于培养瓶底部，在5%CO ₂、37℃、饱和湿度的培养箱中静置培养24小时。

3.适时在倒置显微镜下观察并视情况3~4天换液1次，7~9天后可见大量细胞贴壁生长。此时，用吸管轻轻吸出一半培养液，轻轻摇晃培养瓶，使组织块脱离瓶底，吸弃上清和悬浮组织块并接种到新培养瓶中，加入新鲜培养液继续进行培养，适时观察细胞并换液。至少反复进行3次重复贴壁培养，即可获得常规培养3倍数量以上的原代hUCMSC。

4.培养2周左右细胞可长到80%以上融合状态，此时吸弃培养液并用生理盐水漂洗后，加入适量临床应用级别的0.25%的胰酶，充分混匀，观察到细胞收缩有部分细胞脱落时，立即终止反应，收集细胞悬液到离心管中，300~400g离心10分钟，再加入生理盐水适量离心漂洗，反复3次后，计数活细胞，用完全培养基稀释，收集细胞进行传代培养。

5.传代培养通常采用专用细胞培养瓶，以DMEM/F12培养基为基础，按原代培养密度1∶3的比例进行传代培养。传代培养至第3代，即可获得相当数量的hUCMSC。传代培养的过程是纯化间充质干细胞的过程。收集第三代以后的细胞用于鉴定，鉴定合格的hUCMSC用于制备hUCMSC注射液。

6.长期在体外传代培养的是否会衰老、突变等一直是人们关注的问题，也是影响细胞质量的深层次问题。国外对骨髓间充质干细胞体外长期培养研究发现：如果在体外连续传代培养60次以后就会观察到间充质干细胞衰老和自动向脂肪细胞分化。笔者长期培养实验证明：在体外传代培养8次以内的脐带间充质干细胞安全性和活性是有保证的。连续传代8次以后，个别细胞会发生染色体变异。因此，笔者所在实验室制备hUCMSC注射液使用的细胞是第3~5代的hUCMSC。

脐带间充质干细胞是一群来源中胚层，主要存在于结缔组织和器官间质中，具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，依据国际细胞治疗协会定义的标准，它的鉴定主要包括以下三个方面：

长梭形、旋涡状贴壁生长的成纤维细胞样细胞形态（图7-1）。

流式细胞技术检测hUCMSC表达CD29、CD44、CD90、CD105等表面标志物（图7-2），但不表达CD3、CD4、CD8、CD14、CD34、CD45等造血细胞的表面标志，也不表达与人白细胞抗原（HLA）识别有关的MHC-Ⅱ和CD40和CD80等共刺激分子。

hUCMSC在不同诱导条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种类型细胞。hUCMSC在成脂分化诱导液中培养28天后，可形成大量脂滴，经油红O染色为典型的红色（图7-3A）；同样，在成骨分化诱导液中培养21天后，钙质沉积结节可形成白色结节，经茜素红染色为典型的红色（图7-3B）；采用细胞团块培养方法，在成软骨分化诱导液中培养14天后，可形成软骨特有的氨基葡聚糖，经阿新蓝染色为典型的蓝色（图7-3C），表明hUCMSC具备向脂肪、骨、软骨分化的能力。

获得hUCMSC后配制为可供临床使用且可稳定保存的hUCMSC悬液是制备hUCMSC注射液的最后一个生产环节。经上述程序只是获得了符合生物学特性的hUCMSC，必须严格遵照以下程序和要求完成注射液的配制和包装。除了严格遵守普通间充质干细胞分离扩增的基本程序和要求之外，必须特别注意符合国家卫生部门制定的临床生物制剂的特殊要求。

hUCMSC注射液的配制过程中用到的基础溶媒介质主要为临床上的常用药品，使用这些介质的主要作用是作为细胞悬浮剂和输注的载体。

生理盐水中钠离子54mmol/L、氯离子154mmol/L、pH 5.0左右偏酸性、渗透压308mOsmol/L，主要活性成分为氯化钠，而且其中不含任何营养成分。细胞悬浮于生理盐水中可能因缺乏营养易发生死亡聚集从而减少有效细胞数量，并且聚集成团的细胞在回输注时也会堵塞输血器及微血管，给临床上的使用带来不安全的因素。

复方电解质注射液是一种接近于生理血浆的缓冲液，其中钠离子140mmol/L、钾离子5mmol/L、氯离子98mmol/L、pH 7.4、渗透压294mOsmol/L，都与血浆（钠离子142mmol/L、钾离子4.2mmol/L、氯离子103mmol/L、pH 7.4、渗透压302.9mOsmol/L）的生理浓度等同，避免高氯性代谢性酸中毒，具备强大的酸碱缓冲体系，使得溶液为生理性pH值，且能维持溶液的等张性。目前看，是一种较为理想的基础溶媒。

（1） L-谷氨酰胺在细胞生长过程中具有十分重要的作用，它是提供合成核酸和蛋白质的重要原料，是细胞能源的重要来源，对细胞维持正常的能量代谢至关重要。谷氨酰胺进入三羧酸循环是通过谷氨酰胺-谷氨酸-α酮戊二酸途径，从而为细胞提供能量，有效减轻细胞损害。有研究表明谷氨酰胺能降低机体对无氧酵解的依赖，减少乳酸堆积。

（2） 腺苷是细胞合成重要能源ATP的前体物质，可作为一种保护因子增加细胞内ATP水平，细胞内ATP含量下降，影响细胞的正常生理功能，特别影响细胞膜上相关受体功能。

（1） N-乙酰半胱氨酸不仅是还原型谷胱甘肽的前体物质，还是活性氧自由基清除剂，它可以改善氧化应激引起的不同种类细胞的损伤，牛玉虎等人曾选用N-乙酰半胱氨酸作为移植保存介质中的添加成分。UCMSC悬浮在保存液中，与培养条件下相差甚远，处于相对缺氧状态，细胞内氧化应激水平增加，产生活性氧自由基，这些物质会直接损伤到线粒体，从而影响线粒体氧化代谢中酶的活性，导致NADH减少，ATP合成障碍。N-乙酰半胱氨酸可以清除自由基或增强抗氧化酶活性，对自由基有很强的清除能力。

（2） 亚硒酸钠是细胞培养中常用的添加剂，硒通过参与过氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的作用过程，能够消除氧自由基和氧化物酶对细胞的伤害。另有研究指出硒可以通过提高GSH活性，阻止膜脂质过氧化，打断自由基链式反应，同时硒对溶酶体有稳定作用，可以通过稳定溶酶体膜推迟细胞不可逆损伤的发生。Hewlett研究指出硒在人体细胞的生长过程中有明显作用，硒能消除氧化物酶和氧自由基对细胞的伤害。

胰岛素是细胞培养中的一种重要活性因子，能够促进细胞中RNA、蛋白质以及脂肪酸的合成，能够抑制细胞的凋亡。

肝素为硫酸化的糖胺聚糖，分子量3~30kD，其中硫酸根约占40%，硫酸根呈强酸性，带大量的负电荷，能够起到防止间充质干细胞集聚从而发挥抗凝作用。

可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等，经常使用的是甘油、DMSO。

不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉（HES）等。

白蛋白不仅具有维持血浆胶体渗透压和结合离子的能力，起到维持细胞外液的渗透压平衡的作用；而且人血白蛋白本身所带静电荷为负电荷，能够起到防止细胞集聚而处于分散状态的功能，另外，人血白蛋白是临床常用药物，容易获取且质量可以得到保障，加入到干细胞制剂中使用相对安全。

选取鉴定合格的hUCMSC，用0.25% trypsin-EDTA消化，完全培养基终止，离心去除上清，加入细胞冻存液（10%DMSO、5%甘油、85%的含20%FBS的完全培养基）并悬浮混匀细胞，调整细胞浓度为5×10 ⁶个/ml，分装入无菌冻存管中，冻存管上清楚标注细胞名称、产妇名字、批号和冻存时间并详细记录存档；将冻存管放入程序降温盒中置于-70℃冰箱4小时后转入-196℃液氮罐中保存备用。使用时复苏细胞，离心漂洗后再使用。

在经检验合格符合GMP生产条件且具备完整的干细胞制剂制备质量管理体系的细胞工程实验室无菌条件下选取鉴定和检验合格的hUCMSC，使用临床应用的0.25% trypsin-EDTA消化收集细胞，生理盐水洗涤3遍后，加入临床注射用的细胞冻存液（10%临床级DMSO、5%人血白蛋白、低分子肝素钙1050 IU/4×10 ⁷个细胞、85%复方电解质注射液）并悬浮混匀细胞，调整细胞浓度为2×10 ⁶个/ml，分装入临床用无菌冻存袋中，每个冻存袋装入20ml，冻存袋上清楚标注细胞名称、产妇名字、批号、冻存时间和冻存数量并详细记录存档；把冻存袋放入程序降温仪中完成程序降温后转入-196℃度液氮罐中保存备用，临床上使用前直接从液氮中取出放入37℃专用孵育箱中复苏，然后用生理盐水5倍稀释后使用。该方法本实验室也只在猕猴身上实验，未发现明显不良反应，但要在临床上推广使用还需进行大量研究。

目前还没有一个固定的规格标准，各制备机构依据2015版《中华人民共和国药典》中的相关规定自行定制，普遍的制剂规格标识量为20ml、50ml、100ml。

1.制备机构质量管理部门应对待分装的hUCMSC悬液进行质量审查或检定，对符合质量标准者，发出分装通知后，方可进行分装，有专门规定者除外。

2.分装区域环境及设施　分装区域环境及设施应符合现行中国《药品生产质量管理规范》的要求。分装设备应满足生产工艺的要求，设备表面便于清洁消毒，与干细胞注射剂直接接触部件便于拆卸、清洁、灭菌和再利用。在一种制品分装后，必须进行有效的清洁和消毒，清洁效果应定期验证。分装过程应严格按照无菌操作的要求进行，应进行全过程的微生物和悬浮粒子动态监测并符合要求。

3.分装用容器及用具　分装注射液的最终容器的质量标准，应符合国家药品包装用材料和容器管理的标准，分装容器及用具的清洁、灭菌处理工艺应经验证并确保达到清洁、灭菌效果，应不影响干细胞的生物学特性、活性以及注射液pH值和渗透压。

4.分装人员　直接参加分装的人员，每年至少应做1次健康检查。凡患有活动性结核、病毒性肝炎或其他传染病者，应禁止参加分装工作。进入分装区域的人员应严格限定数量，分装人员应经严格培训考核。

5.制剂分装要求

（1） 同一容器的制品，应根据验证结果，规定分装时间，最长不超过半小时；液体制品分装后立即密封；注射液在分装过程中的温度应根据相关验证试验和稳定性考察结果确定，最高不得过10℃，分装后的制品应尽快移入2~8℃冰柜冷藏贮存，细胞混悬液在分装过程中应保持均匀。

（2） hUCMSC注射液的实际分装量应多于标签标示量，应根据所选用最终容器的尺寸，以及待分装注射液溶液黏度的不同，适度补加装量，以保证每瓶（袋）的抽出量不低于标签上所标示的数量。如：分装100ml者可补加4.0ml；分装50ml者可补加1.0ml。

1.包装前，应按制备机构质量管理部门发出的包装通知单所载有效期准备瓶签或印字戳，瓶签上的字迹应淸楚。

2.在包装时，要与制备机构质量管理部门发出的包装通知单仔细核对批号是否相符，防止包错、包混。在包装过程中，发现注射制品的外观异常、容器破漏或有异物者或有摇不散的凝块、封口不严、有黑头或裂纹应剔除。

3.包装hUCMSC注射液应在10℃以下进行。

4.瓶签应贴牢，不易脱落或模糊，瓶签内容不得用粘贴或剪贴的方式进行修改或补充。直接印字的制品字迹应清楚。

5.同一制品不同规格制品的瓶签及使用说明，应用不同颜色或式样，以便识别。

6.外包装盒标签内容必须直接印在包装盒上。批号和有效期应用打码机直接打印在包装盒上，字迹应清楚，不易脱落和模糊。

7.包装结束后应彻底淸场，并填写清场记录。

8.制品包装全部完成后，在未收到制品合格证前，应封存于待检区。收到合格证后，方可填写入库单，交送成品库。

9.每个最小包装盒内均应附有说明书。

1.hUCMSC注射液包装标签应符合《中华人民共和国药品管理法》及国务院药品监督管理部门的有关规定，不同包装的标签，其内容应根据上述规定印制。

2.包装标签的文字表述应以国务院药品监督管理部门批准的药品说明书为依据，不得超出说明书内容，不得加入无关的文字和图案。

3.内包装标签和外包装标签的内容、格式应符合国务院药品监督管理部门的有关规定。

批号系用以区分和识别产品批的标志。为避免混淆和误差，均应按照本规程分批和编批。

1.hUCMSC注射液的批号应由制备机构质量管理部门审定。

2.hUCMSC注射液批号和亚批号的编制批号的编码顺序为“年、月、年流水号”。年号应写公历年号4位数，月份写2位数，年流水号可按生产企业所生产的干细胞制品批数编2位或3位数。某些干细胞制品还可加英文字母或中文，以表示某特定含义。亚批号的编码顺序为“批号数字序号”，如某制品批号为200801001，其亚批号应表示为200801001-1、200801001-2……

3.同一批号的hUCMSC注射液，应来源一致、质量均一，按规定要求抽样检验后，能对整批制品作出评定。

4.批、亚批及批号确定的原则成品批号应在半成品配制后确定，配制日期即为生产日期。非同日或同次配制、混合、稀释、过滤、灌装的半成品不得作为一批。制品的批及亚批编制应使整个工艺过程淸晰并易于追溯，以最大限度保证每批制品被加工处理的过程是一致的。

5.同一制品的批号不得重复，同一制品不同规格不应采用同一批号。

1.说明书应符合《中华人民共和国药品管理法》及国务院药品监督管理部门有关药品说明书的规定，并根据国务院药品监督管理部门批准的内容编写。

2.hUCMSC注射液说明书应注明相关警示语：因原料来自婴儿附属物组织：脐带，虽然对脐带组织的供体进行了相关病原体的筛查，并在培养制备工艺中也严格无菌操作，加入的培养液及相关营养物质也是有资质的生产商并由其提供相关质量合格证明的制剂；但理论上仍存在传播某些已知和未知病原体的潜在风脸，临床使用时应权衡利弊。

3.在hUCMSC注射液制备过程中，应避免使用抗生素。

1.hUCMSC注射液的贮藏条件（包括温、湿度，是否需避光）应符合细胞储存相关要求，贮藏温度为2~8℃，贮藏时间一般不超过12小时，室温储藏一般不超过2小时。

2.应配备专用的冷藏设备或设施用于hUCMSC注射液贮藏，并按照中国现行《药品生产质量管理规范》的要求划分区域，并分门别类有序存放；仓储区的设计和建造应合理，仓储区应当有足够的空间，确保有序贮藏成品；仓储区的贮存条件应符合制品规定的条件（如温、湿度，避光）和安全要求，应配备用于冷藏设备或设施的温度监控系统；应对冷库，储运温、湿度监测系统以及冷藏运输的设施或设备进行使用前验证、使用期间的定期验证及停用时间超过规定时限的验证；应由专人负责对贮存、运输设施设备进行定期检查、清洁和维护，并建立记录和档案。

3.应建立制剂出入库记录，应建立成品销售、出库复核、退回、运输、不合格细胞制剂的处理等相关记录，记录应真实、完整、准确、有效和可追溯。

为确保hUCMSC注射液使用的安全性和有效性，应对生产的每一批次的hUCMSC注射液进行质量检验，其中包括hUCMSC中间产品（用于制剂配制前）和分装完成的终产品检验，检验的核心内容与前述的UCMSC质量控制内容基本一致之外，还应包括临床生物制剂和干细胞生物学特性的质量控制要求。hUCMSC注射液制备机构应建立系统性的标准操作程序及质量检验方法和标准，通过严格执行hUCMSC注射液制备的标准操作程序，从流程上最大限度地确保产品质量合格、稳定，再辅以hUCMSC中间产品（用于制剂配制前）的鉴定和最终产品的系统批次检验，从关键环节上最大限度地堵死产品质量的疏漏渠道，确保hUCMSC注射液完全合格。hUCMSC注射液质量检验内容包括：

采用直接镜检法观察原代培养的hUCMSC绝大部分（98%）呈成纤维细胞样，大量融合时平行排列或呈漩涡状生长，可见到2~3个核仁，胞质晶莹透亮。随着传代的次数增加细胞可变为扁平状，胞质内出现大小不等的颗粒。对于出现明显生长形态改变的hUCMSC，不宜用于制备hUCMSC注射液。

原代培养的hUCMSC一般活性较好，传代后潜伏期短、细胞倍增时间短，细胞多为长梭形。经长期的培养后活性会有所下降，潜伏期变长，倍增时间延长，形态变扁平或变不规则。

可采用不同的检测方法，如台盼蓝染色活细胞计数、细胞倍增时间、细胞周期等判断细胞活性及生长状况。

一般采用台盼蓝拒染法观察，如果细胞膜不完整或有破损，台盼蓝染料进入细胞内致使细胞变蓝，即为死细胞。如果细胞膜完整，细胞不被台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞，可以根据该公式计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%，活细胞比例应>98%。

在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需的时间，即倍增时间，一般通过生长曲线测定（计数法或MTS法）。用正常完全培养基重悬细胞后需要调整浓度，再取 0.1ml/孔加入 96孔板培养，分别在培养的 1、2、3、4、5、6、7、8天取出，换液后加入MTS检测试剂盒37℃培养4小时后，490nm处检测吸光度值，以时间为横轴，吸光度值为纵轴绘制生长曲线。注意中途每3天给细胞换液。

碘化丙锭（PI）染色流式检测法，由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量（2N），而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量（4N），而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，可通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测，由此可知细胞周期的分布情况并确知细胞的倍体是否正常。hUCMSC的细胞周期显示80%的细胞都处于G0/G1。

对于经过数代培养的hUCMSC，应进行无污染检查，以保证未被其他类型细胞污染；或通过检测细胞表面标志物的方法，对制剂进行细胞纯度或均一性的检测。

可以通过流式细胞仪或细胞免疫化学法检测，各个hUCMSC制备实验室可根据自己的实际情况选择适合自己的检测方法，下面以流式细胞仪为例说明具体操作方法：一般选择处于对数生长期的P3~P5代细胞，胰酶消化细胞，完全培养基终止消化，吹打均匀，充池计数，一般取1×10 ⁶个细胞为1~2个细胞表面标记检测用量，加入PBS充分洗涤3次，分别加入荧光标记的表面抗体避光4℃孵育30分钟或者避光室温孵育20分钟，加入PBS充分洗涤1次，上流式仪检测。脐带间充质干细胞是一群异质细胞，没有一个固定的表面标记物，一般选择CD29、CD34、CD45、CD90、CD106、CD105这几个经典指标进行检测，已知脐带间充质干细胞CD29、CD44、CD90、CD106、CD105呈阳性，且阳性率不低于95%，CD34、CD45、HLA-DR呈阴性，阳性率不高于2%；P3代以内的细胞表面标记物表达随着代次的增加阴性标记越来越少，阳性标记越来越多。

hUCMSC经过长期的体外培养，染色体核型分析结果应显示其核型为正常核型（46，XX/XY）且无易位、倒位、缺失、复制和融合等异常现象，证明hUCMSC的核型稳定。

收集待检的hUCMSC，按照1×10 ⁵/cm ²接种到12孔板中静置培养，至到细胞100%甚至过度融合时，吸去10%FBS的DMEM/F12培养基，加入成脂分化诱导培养液，每3天换液1次，诱导培养14天后，4%多聚甲醛固定30分钟后染色，显微镜下观察拍照。

（油红O染色）成脂肪诱导的过程中，细胞在胞质中不断有滴的累积，并不断的增加变大，最后整个细胞的胞质中都是油滴。油红O染色的方法是对油滴的染色的一种方法。

收集待检的hUCMSC，按照5×10 ⁴/cm ²接种到12孔板中静置培养，至细胞60%~70%融合状态时，吸去10%FBS的DMEM/F12培养基，加入成骨分化诱导培养液，每3天换液1次，诱导培养21天后，4%多聚甲醛固定30分钟后染色，显微镜下观察拍照。

（茜素红染色）成骨诱导过程中钙离子以钙盐的方式沉淀下来，形成“钙结节”，茜素红和钙发生显色反应，产生一种深红色的带色化合物，这样成骨诱导的细胞外沉积的钙结节也就被染成深红色。

收集待检的hUCMSC，调整细胞浓度为1.6×10 ⁷/ml，取 5μl接种12孔板中，静置于37℃，5%CO ₂培养箱中培养2小时，缓慢加入成软骨分化培养基静置培养，每3天换液1次，培养14天后，4%多聚甲醛固定、石蜡包埋软骨小球病理切片，脱蜡后染色，显微镜下观察拍照。

（阿利辛蓝染色）检测软骨细胞分泌基质中的葡萄糖胺聚糖，可使软骨中硫酸软骨素、硫酸胶质素等主要成分呈现蓝色。

应依据现行版《中华人民共和国药典》中的生物制品无菌试验和支原体检测规程，对细菌、真菌及支原体污染进行检测。

每批次中间产品（用于制剂配制前）hUCMSC和最终产品hUCMSC，都应进行无菌检验。一般在培养开始后3~4天起每间隔一定时间取培养液上清，按2015版《中国药典》生物制品无菌试验规程进行或者采取取培养上清离心沉淀物后/或细胞用丫啶橙染色或革兰染色，显微镜下进行有无污染的检测。无论是取培养上清进行无菌培养实验还是取上清离心沉淀或取细胞沉淀革兰染色镜检，都必须是无细菌、无真菌才符合要求。

每批次中间产品（用于制剂配制前）hUCMSC和最终产品hUCMSC，都应进行无支原体检验。培养细胞的支原体检测方法有两种，一种方法是取培养液上清直接接种培养法检测，该方法耗时长，但这对每批细胞制剂又是比较可靠和必需的检测。另一种方法是取细胞通过PCR的方式检测，该方法相对耗时短，特异性较高。无论哪种方法检验都必须是阴性结果才符合要求。

首先严格执行排除产妇血液带有病原微生物（HAV、HBV、HCV、HEV、TPPA、EBV、HCMV），其次，每批次中间产品（用于制剂配制前）hUCMSC和最终产品hUCMSC，都应进行无致病因子检验，以便排除hUCMSC注射液带有人源致病微生物（HAV、HBV、HCV、HEV、TPPA、EBV、HCMV）及动物源性特定致病因子（如疯牛病病毒、猪源细小病毒；另外还应检测反转录病毒（HIV）等。以上相关病毒均可采取PCR的方法进行检测，并且必须均为阴性。

应依据2015版《中华人民共和国药典》中的内毒素检测规程中的凝胶法，对每批次中间产品（用于制剂配制前）hUCMSC和最终产品hUCMSC，都应进行内毒素检测。凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法，内毒素检测标准为≤5EU/ml。

主要是对hUCMSC注射液生产过程中残余的、影响hUCMSC注射液质量和安全性的成分，如牛血清蛋白、抗生素、细胞因子等进行检测。其中，牛血清残留量检测使用牛血清白蛋白（BSA）酶联免疫法或间接凝集法，判定标准为牛血清残留量不得大于50ng/ml。抗生素残留量检测采取培养法，标准为阴性；人表皮生长因子采用ELISA的方法检测，应不大于100pg/ml。

hUCMSC对免疫系统的调节作用十分复杂，在体内具有双向性，即对低免疫反应的个体有促进作用，而对免疫功能过强的个体则有抑制作用。而在体外，报道更多的是抑制作用。hUCMSC对多种免疫细胞的分裂增殖、免疫调节因子的分泌及免疫杀伤活性有一定抑制作用，因此检测hUCMSC注射液的免疫调节功能是其质量检测的重要指标。hUCMSC注射液的免疫调节功能检测主要是异体来源hUCMSC对正常人外周血总淋巴细胞增殖和对不同淋巴细胞亚群增殖能力的影响，或对相关细胞因子分泌的影响，以检测hUCMSC可能引起的异常免疫反应。用于hUCMSC的免疫调节功能检测的靶细胞可以是混合淋巴细胞，也可以是分离纯化的淋巴细胞亚群，也可以用NK细胞。采用T淋巴细胞为靶细胞时，判定标准是hUCMSC浓度为2×10 ⁵个/ml时，对T淋巴细胞增殖抑制率不低于50%。值得注意的是UCMSC对免疫功能的调节作用具有双向性，在检测时应充分考虑各个方面的因素，对结果应作综合判断。也可采用hUCMSC与淋巴细胞共培养后检测淋巴细胞的免疫调节因子分泌功能，其中包括IFN-γ、IL-2、IL-10等。有研究表明，hUCMSC对免疫调节功能的调节作用具有IFN-γ依赖性，即IFN-γ具有增强hUCMSC的免疫调节功能的作用，应在实施hUCMSC免疫调节功能检测时纳入考虑因素。

hUCMSC注射液呈分散均匀的细胞悬液状态，成品外观肉眼观察应为无色或微黄、均匀的混悬液，无明显的沉淀物、絮状物及其他无异物。制剂规格通常为1×10 ⁵~5×10 ⁵个/ml，分装体积为20~50ml/份，一般采用无色透明的血袋分装、保存，每剂的最低装量应为（20±2）ml。包装必须采取符合2015版《中华人民共和国药典》中的包装要求，包装材料必须是无菌、无色透明、不吸附细胞，不影响细胞活性。综合上述这些hUCMSC注射液产品特点，可通过肉眼观察，初步判定其质量，这对hUCMSC注射液的临床使用前质量检验十分重要，至少通过肉眼观察可以排除因为长期储存、复苏及运输过程导致的hUCMSC注射液质量变化，以保证临床应用的安全性。

总之，hUCMSC注射液的质量检验是保证其临床应用安全性和有效性的关键，质量检验应涵盖hUCMSC注射液制备的全过程，应对hUCMSC注射液制备过程中的中间产品和终产品进行全面的质量检验，才能有效保证hUCMSC注射液标准化和安全性。目前存在的问题是hUCMSC注射液的质量检验技术体系尚不够完善，指标体系设置尚不够全面，技术方法尚需要进一步改进和完善并形成规范，关键问题是还缺乏临床应用前的快速检测技术手段。随着hUCMSC注射液质量检测技术的发展，一些现代检测技术，如生物芯片、转录组测序、生物标记技术、体内示踪技术等的快速发展，更精准、快速、灵敏、高效的检测技术将用于hUCMSC注射液的质量检验。经过质量检验合格的hUCMSC注射液可以用于第三方的安全评价试验和其他试验研究。