第4节　E.coli基因组DNA的提取

一、实验目的

（1）了解原核生物E.coli基因组DNA的制备原理及各种试剂的作用。

（2）掌握原核生物E.coli基因组DNA的提取和检测方法。

二、实验原理

基因组DNA的提取是构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR等的重要环节^［6～8］。提取基因组DNA通常要求分子量尽可能大，以增加外源基因的获得率，所以要温和操作，减少剪切力，尽量低温操作^［9，10］。细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程中要抑制其核酸酶的活性。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中的溶解度可达40g/L，DNA在水中的溶解度为10g/L，呈黏性胶体溶液。

在酸性溶液中，天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白（DNP）的形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把蛋白质除去，再除去细胞中的糖、RNA及无机离子等，从中分离DNA。DNP和核糖核蛋白（RNP）在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠中溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中的溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。

Bandyopadhyay等比较了苯酚-氯仿法、试剂盒法和磁性分离法提取细菌基因组DNA^［10］，如表1-3所示。

磁性分离法的成本虽然不高，但市场售价仍然是比较昂贵的。苯酚/氯仿法是目前耗时但较为廉价的方法。E.coli基因组DNA提取过程中，使用苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白质与DNA的连接键已断，蛋白质分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白质分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态，真核细胞DNA的分离通常是在EDTA及SDS一类去污剂的存在下，用蛋白酶K消化细胞获得的。

三、材料、试剂与仪器

1.实验材料

E.coli发酵液。

2.实验试剂

苯酚/氯仿/异戊醇混合液（苯酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1，体积比）、氯仿/异戊醇混合液（氯仿∶异戊醇=24∶1，体积比，溶液Ⅰ）、异丙醇、70%乙醇、95%乙醇、100mg/mL磁性粒子、10%（质量浓度）SDS溶液、无菌超纯水，YPD培养基、RNase A溶液、TE缓冲液、0.7%的琼脂糖凝胶配制见附录Ⅲ。

DNA结合液：10g PEG6000溶解于100mL 1.25mol/L的NaCl溶液中。

10mg/mL蛋白酶K：100mg蛋白酶K溶解于10mL 50mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 7.5，10mmol/L CaCl₂）中，分装，20℃贮存。

10mg/mL溶菌酶：100mg溶菌酶溶解于10mL TE缓冲液中，20℃贮存。

3.实验仪器

台式高速离心机，恒温振荡摇床，涡旋振荡器，恒温水浴锅，磁铁或磁力架，电泳仪、电泳槽、离心管、凝胶自动成像仪、NanoDrop 2000C超微量分光光度计、微量移液器（20μL、200μL、1000μL）。

四、实验步骤

1.酚-氯仿法

（1）1mL E.coli菌体发酵液，10000r/min离心1min，去上清液。

（2）加750μL溶液Ⅰ，悬浮沉淀，并加溶菌酶使其终浓度为1mg/mL，37℃保温0.5h。

（3）悬液中加入蛋白酶K溶液，使其终浓度为0.1mg/mL，混匀，55℃保温1h。

（4）加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇上下颠倒混匀，10000r/min离心5min，将上清液移至干净离心管中，然后再用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次。

（5）用等体积氯仿/异戊醇抽提，10000r/min离心5min，取上清液移至干净离心管中。

（6）加等体积异丙醇，颠倒混合，-20℃静置20min，沉淀DNA，10000r/min离心5min，弃上清液。

（7）DNA沉淀加入1mL 70%乙醇吹打混匀，4℃10000r/min离心5min，弃上清液，风干乙醇，溶解于50μL的TE缓冲液中。

（8）最后贮存液中加入1μL RNase A溶液，终浓度为20μg/mL。

2.商品试剂盒法（按商品说明书操作即可）

3.磁珠法

（1）1mL E.coli菌体发酵液，10000r/min离心1min，去上清液。

（2）加450μL TE缓冲液并充分悬浮，并加入50μL、0.1g/mL（质量浓度）的SDS溶液，颠倒混合2～3次。

（3）50℃温浴90s，悬液显示白色黏稠状。

（4）50μL 100mg/mL（TE缓冲液悬液）磁性粒子加入到上述悬液中，再加入500μL的DNA结合液，轻柔颠倒混合几次，室温保持3～5min。

（5）磁性分离，磁性粒子用95%乙醇洗涤、70%乙醇洗涤之后，室温下风干。

（6）磁性粒子悬浮在30μL的TE缓冲液中，轻柔颠倒几次，室温保持10min。

（7）磁性分离，上清液转移到新的离心管中，即为E.coli基因组DNA。

（8）DNA的TE缓冲液0.7%琼脂糖凝胶电泳，拍照。

（9）DNA的TE缓冲液稀释一定倍数后，测定OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀，以确定DNA含量和质量。

五、结果与分析

文献报道几种方法提取E.coli基因组DNA序列长度均应为23.1kb，其琼脂糖凝胶电泳结果见图1-3。

六、注意事项

（1）裂解液要预热，以抑制DNase，加速蛋白变性，促进DNA溶解。

（2）各操作步骤要轻柔，尽量减少DNA的人为降解。

（3）苯酚-氯仿法取各上清液时，不应贪多，以防非核酸类成分干扰。

（4）异丙醇、乙醇、CH₃COONa、CH₃COOK等要预冷，以减少DNA的降解，促进DNA与蛋白质等的分相及DNA沉淀。

（5）提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。

（6）所有试剂均用高压灭菌超纯水配制。

（7）蛋白酶K使用前60℃孵育30min，以提高其活性。

七、思考题

（1）为何市售RNase A使用前必须进行热处理？冷却过程应注意什么问题？

（2）简述提取基因组DNA的原理和注意事项。

（刘长霞）